作者

吴江丽,刘悦,蒋素芳,董振明

　（医院麻醉科）

摘要

目的　探讨七氟醚预处理早期对大鼠心肌缺血再灌注心肌保护作用及对心肌细胞自噬的影响。方法　清洁级雄性SD大鼠45只,8～12周龄,体质量～g。随机分为假手术组（Sham组,n=15)、缺血再灌注组（I/R组,n=15)和七氟醚预处理组（Sevo组,n=15)。采用冠脉阻断30min再灌注min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。Sevo组于缺血前30min行七氟醚预处理:吸入2.5%七氟醚15min,洗脱15min。随后结扎左前降支,阻断冠脉血流30min后,解除阻断再灌注min。再灌注min时测定肌钙蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的浓度、心肌梗死面积、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况。结果　与Sham组比较,I/R组心肌cTnI和CK-MB浓度升高,心肌梗死面积增加,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达上调（P0.05）;与I/R组比较,Sevo组心肌cTnI和CK-MB浓度降低,心肌梗死面积减少（P0.05）,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达差异无统计学意义（P0.05）。结论　七氟醚预处理早期能减轻心肌缺血再灌注损伤,但是七氟醚预处理早期未显著影响心肌细胞自噬水平。

「关键词」心肌;缺血再灌注损伤;七氟醚;预处理;自噬

　　心肌缺血再灌注损伤常见于心脏手术患者,主要表现为受损心肌炎性细胞聚集、血管内皮受损、心律失常及心肌顿抑等[1],影响患者预后。研究表明心肌细胞自噬在缺血再灌注过程中被激活[2],缺血期的自噬处于较低水平,可有效减少心肌细胞死亡;而再灌注期过度的心肌自噬可诱发心肌细胞死亡[3-4]。七氟醚作为吸入麻醉药常用于临床,可有效减轻心肌缺血再灌注损伤[5-6],但七氟醚能否通过调节心肌细胞自噬减轻心肌缺血再灌注损伤有待研究。本研究拟通过建立心肌缺血再灌注模型,检测心肌酶浓度、心肌梗死面积、自噬相关蛋白(Ⅱ型微管相关蛋白轻链3和Beclin-1蛋白)[7]的表达,探讨七氟醚预处理早期对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞自噬的影响,为相关的临床应用提供理论基础。

1　材料和方法

1.1

材料

　　由河北医科大学实验动物中心提供的清洁级健康雄性SD大鼠45只,8～12周龄,体质量(±20)g,随机分为假手术组(Sham组,n=15)、缺血再灌注组(I/R组,n=15)和七氟醚预处理组(Sevo组,n=15)。

1.2

方法

1.2.1　实验动物的麻醉与管理　3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射,麻醉成功后(钳夹尾部无体动反应)将其仰卧位固定于实验台上,通过调节在其躯干上方放置的60W白炽灯到大鼠躯干的距离和更换在躯干下方放置的自制暖水袋,使肛温维持在37.0～37.5℃,监护仪(BL-F生物机能实验系统—成都泰盟科技有限公司)的针型电极连接到四肢,持续检测Ⅱ导联心电图。气管插管后连接小动物呼吸机HXB(成都仪器厂)行机械通气,(进气口与麻醉机相连)并连接多参数麻醉气体监测仪(德国Dragermedical)出现PETCO2波形后,设定VT5~7mL/g,RR60次/min,吸呼比1∶2,调整通气量PETCO2维持35～45mmHg。于左侧颈总动脉穿刺置管监测有创动脉压,测压传感器末端接肝素盐水,外用加压带加压,持续滴入肝素盐水预防动脉置管处血液凝固。颈动脉穿刺失败或在穿刺过程中失血过多(除颈动脉穿刺部位滴注肝素盐水外无其他液体输注亦不用血管活性药物人为控制血压),致MAP＜90mmHg的大鼠剔除本实验。假手术组剔除大鼠2只,皆因动脉穿刺失败致使循环不能维持;缺血再灌注组剔除4只,1只因动脉穿刺失败,2只因结扎冠脉后室颤未到观察时间死亡所致,1只因结扎冠脉时损伤冠脉致MAP＜90mmHg所致;七氟醚预处理组3只剔除实验,2只动脉穿刺未成功,1只结扎冠脉时损伤冠脉致MAP＜90mmHg。

1.2.2　缺血再灌注模型建立　于左胸壁3~4肋间距离胸骨左缘约0.5cm处切约3cm的刀口后,逐层钝性分离至胸腔,剪开心包,充有肝素盐水(12.5U/mL)的24G动脉穿刺针从左心房底部刺入,退出针芯,在外套管进入左心室0.5～1cm后,连接传感器测量左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVDEP)及左心室舒张最低压(LVDP=LVSP-LVDEP)。以6-0prolene缝合线结扎左冠状动脉前降支,阻断冠状动脉血流,并开始计时。阻断30min后剪开结扎线,左前降支血流恢复灌注,观察min,以上为制备心肌缺血再灌注模型过程。若结扎部位远端心肌发绀且收缩运动减弱,MAP下降;心电图QRS波宽度及高度增加,ST段抬高,T波增高,且与缺血前相比有明显差异,为缺血成功的标志。恢复灌注后若左室相比缺血期运动幅度逐渐增大且心肌颜色渐红;同时QRS波宽及波高、T波ST段均明显下降,但仍高于缺血前水平;且MAP较缺血期末升高,此为再灌注成功的标志。心肌缺血再灌注模型制备不成功、实验计划时间未到而死亡的大鼠将不纳入本实验。

1.2.3　处理方法　Sham组,左冠状动脉前降支下穿线不结扎观察min;I/R组,阻断冠脉血流30min,之后再灌注min;Sevo组,于阻断冠脉血流前30min行七氟醚预处理:吸入七氟醚使呼出气中七氟醚浓度达2.5%(本实验通过MET-麻醉机七氟醚挥发罐吸入七氟醚,麻醉机呼吸回路与HXB小型动物呼吸机进气口端相连,多参数麻醉气体监测仪可检测吸入麻醉药浓度),维持15min后,洗脱15min。随后结扎左前降支,阻断冠脉血流30min后,解除阻断后再灌注min。

1.3

观察的参数

1.3.1　血流动力学参数　记录房室导管放置后稳定10min(T0)、冠脉血流阻断即刻(T1)、缺血30min(T2)、再灌注10min(T3)、再灌注30min(T4)、再灌注60min(T5)和再灌注min(T6)时的LVSP和LVDEP,及相应的左心室舒张最低压(LVDP=LVSP-LVDEP)。

1.3.2　心肌酶学测定　所有实验动物于再灌注结束后抽取颈动脉血3mL,r/min离心15min后取上清液,置于-70℃冰箱备用。分别用ELISA法和双抗体夹心法测定磷酸肌酸同工酶(creatinekinase-MB,CK-MB)的含量及肌钙蛋白I(cardiactropineI,cTnI)的浓度。

1.3.3　心肌梗死面积测量　取血后于原位重新阻断冠脉血流,每组随机取5只动物,经颈动脉注入2mL的1%伊文氏蓝,之后夹闭主动脉行冠脉灌注1min,可发现危险区(areaatrisk,AAR)心肌不染色,而正常区域呈深蓝色,摘取心脏并用0℃生理盐水中漂洗,用滤纸吸干后用保鲜膜包裹,放置于-20℃冰箱中1h,平行房室沟方向将左心室切成厚1～2mm的薄片4～6片。之后在避光的37℃的1%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液(pH7.4)振荡孵育15min,最后将其压平后用10%甲醛中固定24h拍照。可见非缺血区表现为蓝染,缺血未梗死部分呈红色,苍白色部分为梗死区(infarctsize,IS)。IS面积及ARR面积采用Image-ProPlus5.0图像处理软件以求积法测定,IS面积以IS/AAR的百分比表示。

1.3.4　电镜和Westernblot的标本采集　各组从做Evensblue-TTC双染色外的其余10只大鼠中,随机取5只,取血后重新阻断冠脉,快速摘取心脏,从结扎线下约0.5cm处取一小块心肌,修剪为1mm×1mm×1mm的小块,随即在预冷的40g/L戊二醛中固定,制作电镜标本,用于观察心肌超微结构和自噬。将其余5只大鼠的左心室置于液氮中,以便用Westeronblot法测定LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达。

1.3.5　统计学分析　采用SPSS16.0统计学软件,正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采单因素方差分析,重复测量设计的计量资料采用重复测量设计的方差分析,P0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1

血流动力学指标

　　LVDP:T0-1时3组间差异无统计学意义(P0.05);T2-6时I/R组和Sevo组均比Sham组明显降低(P0.05);Sevo组与I/R组相比明显升高(P0.05,表1)。

表1　三组大鼠左心室舒张最低压各时间点的比较（x±s）

2.2

心肌酶学、梗死面积、LC3-Ⅱ

和Beclin-1蛋白表达

　　与Sham组比较,I/R组心肌cTnI和CK-MB浓度升高,心肌梗死面积增加,LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达上调(P0.05);与I/R组比较,Sevo组心肌cTnI和CK-MB浓度降低,心肌梗死面积减少(P0.05),LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达差异无统计学意义(P0.05,表2,图1)。

表2　三组大鼠心肌cTnI和CK-MB浓度、心肌梗死体积、心肌LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达的比较（x±s）

图1　三组大鼠心肌LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达情况

2.3

电镜下表现

　　Sham组可见肌原纤维排列整齐,肌节结构清晰,有较完整的线粒体结构、无水肿,仅有极少的自噬空泡;I/R组肌原纤维则较紊乱,肌节结构不清晰,线粒体外膜破坏、明显肿胀,并可见断裂及溶解现象,可见有大量自噬空泡及溶酶体围绕在肿胀的线粒体周围;与I/R组比较,Sevo组心肌损伤较轻,有更整齐的纤维排列,且线粒体肿胀较轻,自噬空泡和溶酶体也更少（图2）。

箭头标注的为自噬体或溶酶体.

图2　三组大鼠心肌组织结构比较（A:×0;B:×00）

3　讨论

　　本研究结果显示,七氟醚预处理早期能减轻心肌缺血再灌注损伤,但是七氟醚预处理早期未明显影响心肌细胞自噬水平。

　　由于大鼠冠脉侧支少、发育稳定,解剖与人类心血管系统相近,廉价且容易获得等特点,成为制做心肌缺血再灌注动物模型的首选[6]。

　　目前用于减少心肌缺血再灌注损伤的常用方法有预适应[8-9]和药物预处理。尽管缺血预适应能够有效的保护缺血心肌并能够有效的减轻再灌注损伤,但缺血预处理操作本身对心脏造成一种伤害、操作难度大及心肌缺血事件不可预见性致使其临床应用受到限制[10]。

　　药物预处理分为西药预处理、中药预处理和麻醉药预处理3类[11]。其中吸入麻醉药预处理(inhalationanestheticpreconditioning,IAPC)的心肌保护作用在多种动物实验模型中被证实。有学者将七氟醚预处理(sevofluranepreconditioning,SPC)的心肌保护作用分为早期保护及延迟性保护。其中七氟醚早期保护是指七氟醚预处理即刻至再灌注后3～4h[12]的保护,延迟性保护又名第二保护窗(secondwindowofprotection,SWOP)即吸入七氟醚24h后产生持续长达72h的保护[13]。鉴于SPC有较宽的时间窗,且使用方便,可通过在可能引起心肌缺血/再灌注损伤的外科手术前给予,预防或减轻相关损伤,改善患者预后[14]。

　　心肌收缩功能减弱是心肌缺血再灌注损伤的客观表现。心肌收缩能力减弱表现为左心室舒张最低压。本实验中,与Sham组比较,I/R组、Sevo组的LVDP明显降低,提示心肌收缩力降低,亦表明制模成功;而与I/R组相比,Sevo组的LVDP明显升高,表明七氟醚预处理可有效减轻心肌缺血后再灌注损伤。

　　心肌梗死时常伴有心肌酶浓度的升高[15]。临床上常用的心肌酶学指标有CK-MB、cTnI。

　　本实验结果表明,I/R组及Sevo组与Sham组比较,CK-MB、cTnI的浓度明显升高,再度证实心肌缺血再灌注模型制备成功,并提示I/R后,心肌细胞正常结构破坏,心肌细胞的能量代谢受到影响,最终心肌收缩力降低;而Sevo组的cTnI、CK-MB浓度相比I/R组明显降低,说明七氟醚预处理可有效减少心肌酶释放进而有效减轻心肌细胞损伤,保护心肌细胞正常结构及代谢。同时Sevo组心肌梗死面积相比I/R组缩小,从病理学上进一步证明七氟醚预处理的心肌保护作用。电镜结果从超微结构上证实预处理早期能够减轻心肌缺血再灌注损伤。

　　自噬是将衰老、受损的细胞器和蛋白质降解为氨基酸和脂肪酸等产物,并将其释放至细胞质内供再次结构合成及产能使用,对维持真核细胞中蛋白质内稳态不可或缺。大量的在体、离体及细胞实验表明,心肌缺血期及缺血后再灌注期心肌细胞自噬均被激活[2,16],但自噬对缺血再灌注心肌细胞的作用仍在争议。Petrovski等[17]研究表明,0.3mg/kg毒胡萝卜素在心肌细胞缺血缺氧前给药,可使离体大鼠心肌自噬的表达水平上调,能改善血流动力学指标,最终使心肌梗死面积减少,本研究亦表明心肌细胞自噬对缺血再灌注心肌具有保护作用;另有研究表明,敲除了Beclin-1基因组的小鼠,其心肌缺血再灌注期间的心肌细胞自噬水平明显低于野生组小鼠,且心肌梗死面积亦明显降低[3],说明降低缺血再灌注期间心肌细胞自噬反而对减轻心肌损伤有利;多数研究证明心肌细胞自噬是把“双刃剑”[18]:适度的对心肌细胞具有保护作用,但过度自噬又能对细胞死亡(Ⅱ型程序性细胞死亡)加速。哺乳动物发生自噬时,自噬泡膜的内膜上的LC3-Ⅱ(Ⅱ型微管相关蛋白轻链3)的明显增加,且其表达量与自噬泡的数量呈正相关。另一参与自噬过程且其表达量与自噬水平也呈正相关的是由Beclin-1(自噬相关基因)表达的Beclin-1相关蛋白。因此,测定LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达水平即可推断心肌细胞的自噬强度[7]。本研究发现,与Sham组比较,其余2组可见,LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达量明显升高,且在电镜下观察自噬泡及溶酶体的数量明显增加,说明心肌细胞自噬在心肌缺血再灌注过程中被激活。

　　Qiao等[19]研究发现,于七氟醚预处理24h后随机取组内1/2大鼠心脏,制电镜切片,发现与对照组比较,自噬空泡数量明显增多,LC3-Ⅱ表达相比对照组也增加,表明在七氟醚预处理24h后心肌自噬水平上调;另1/2大鼠心脏于七氟醚预处理后进行缺血再灌注损伤实验,预处理24h后测定心肌梗死面积。发现相比对照组,七氟醚预处理24h后大鼠心肌梗死面积明显减少。说明对大鼠心肌缺血再灌注损伤七氟醚预处理具有延迟性保护作用,且该作用可能与上调缺血前的心肌细胞自噬水平有关。Shiomi等[20]研究发现在七氟醚对离体豚鼠心脏氧化应激的保护作用中上调了心肌自噬。本实验结果显示,Sevo组与I/R组的LC3-Ⅱ、Beclin-1在再灌注末的表达量无明显差异,且电镜下自噬细胞的数量亦未见明显差异,提示七氟醚预处理早期保护作用并未伴有自噬水平的明显变化,七氟醚预处理早期保护作用可能是通过其他机制产生;也可能由于七氟醚预处理激活AMPK增强自噬,而同时又上调Bcl-2,抑制Beclin-1依赖性自噬,二者作用相抵显示自噬水平无变化,但这需要大量的动物实验证实。本实验结果与Qiao[19]和Shiomi[20]等结果出现差异可能与研究方法不同(是否在体研究)、物种、时相不同有关,虽然七氟醚预处理早期作用和延迟作用有很多相同的特征,但它们可能涉及不同的信号通路,其内在联系及机制有待进一步研究。

　　本实验研究表明,七氟醚预处理能减轻心肌缺血再灌注损伤,但是未提示与心肌细胞自噬有关。

点

击

下

图

查

看

截止日期：

年6月30日

参考文献见《麻醉安全与质控》杂志官方网站

外伤白癜风
北京中科白癜风出席健康中国公益盛典


转载请注明:http://www.qolku.com//mjccyy/10121.html