本文刊于:中华心血管病杂志,,46(1):69-73

作者:王红廖扬崔翰斌

单位：宁波大学医学院　英国谢菲尔德大学生物工程学院　医院心内科

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22个核苷酸片段的内源非编码RNA，在动植物体内起着重要的调节作用[1]。miRNA最早发现于秀丽隐杆线虫体内[2]，并陆续发现其在细胞内参与信使RNA的调节作用，与多种疾病的形成有关。除了存在于细胞内，miRNA也存在于胞外环境中。最先发现miRNA存在于胞外的是Chim等[3]，他们发现胎盘中的miRNA出现在孕妇外周血浆中。这些研究开启了人们对胞外miRNA的探索。随后，越来越多的研究表明，miRNA也可以稳定存在于其他体液中，包括唾液、尿液、乳汁、泪液、羊水、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、腹膜液和胸膜液等[4]。在不同体液中，miRNA的类别和浓度存在差异[4]，而且血液中miRNA浓度和类别的变化与多种疾病相关。这提示循环miRNA可以充当一种生物标志物来辅助诊断某些疾病，包括急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)[5]。目前学者对循环miRNA的生物学意义并未达成共识。本文总结循环miRNA的存在形式及其在急性心肌梗死患者中的诊断价值，以更好地理解胞外循环miRNA的存在意义。

一、循环miRNA的存在形式

由于血液中广泛存在核糖核酸酶，起初人们并不认为miRNA能稳定存在于血液中。直到年后,研究先后发现miRNA可以在细胞外和血液两种环境中稳定表达[6,7]。目前，血液中的miRNA主要以两种形式存在，一种是以膜来源的胞外囊泡形式存在，另一种是以非囊泡的结合蛋白形式存在，包括脂蛋白如高密度脂蛋白(high-densitylipoproteins,HDL)和核糖核蛋白如Ago蛋白。

（一）以囊泡形式存在的循环miRNA

当前，越来越多证据表明血液中具有以胞外囊泡形式存在的miRNA[8,9]。胞外囊泡指细胞分泌或释放的膜包裹的微粒。根据囊泡的来源不同，胞外囊泡可进一步分为多种亚型，包括核外颗粒(来源于嗜中性粒细胞和单核细胞)、微粒体(来源于内皮细胞和血小板)、前列腺小体(从精液中分离提取)和心肌小体(从心肌细胞分泌物中获得)等[10]。其中微粒体是近年来心血管疾病的研究热点，许多研究者试图将微粒体与miRNA联系起来，为急性心肌梗死事件的发生和诊断提供新思路。

1．微粒体：

血液中微粒体的水平在多种血管疾病中都会发生变化，可以看作血管疾病的诊断标志物[11]。内皮细胞源性微粒体(endothelialmicroparticles,EMP)是内皮细胞激活或凋亡时从膜表面脱落的一种囊泡，直径0.1~1.0μm，表面含有膜蛋白和受体。囊泡内含有各种酶、转录因子、信使RNA和miRNA等[12]。内皮细胞在生理和病理情况下均可以释放EMP，但囊泡内所含成分不同，血液中EMP及囊泡内miRNA的改变间接反映了内皮的状态[13]。越来越多证据表明，EMP在AMI的发生和诊断中扮演着重要的作用。Zhang等[14]在AMI患者、稳定性冠心病患者和健康者血浆中发现，AMI患者中的EMP和miR-92a水平远高于其余两组，且EMP与miR-92a相关。两者在AMI中的诊断价值又与心肌肌钙蛋白（cardiactroponin,cTn）的敏感度和特异度相近，可以作为AMI的诊断标志物[14]。除了在AMI中的诊断价值，以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发病过程中也发挥重要的作用，可加快疾病进展或触发修复反应。Jansen等[15]发现，向颈动脉受损小鼠注射EMP后，颈动脉内皮再生速度增加。他们还进行EMP芯片分析，发现miR-在EMP中高表达，并进一步发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-的EMP，其作用于冠状动脉内皮细胞中的靶蛋白SPRED1，从而影响内皮细胞的迁移、增殖和再生，促进受损内皮修复[15]。他们还发现凋亡的内皮细胞可以释放富含miR-的EMP，并可以进入血管平滑肌细胞，影响其增殖。他们进一步对比裸露的miR-对血管平滑肌的影响，发现只有以EMP形式存在的miR-才可以抑制血管平滑肌增殖，限制新生内膜形成[16]。以上研究表明，以EMP形式存在的循环miRNA在心血管疾病的发生中发挥重要的作用。

以胞外囊泡形式存在的循环miRNA，除了根据细胞来源进行分类，还可以根据不同的生物学通路模式分为多种亚型，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。

2．外泌体：

外泌体是一类大小为30~nm的囊泡，起源于胞内溶酶体途径，通过多泡体质膜融合向内出芽释放[17]。外泌体内不仅含有蛋白质和信使RNA等成分，还含有miRNA[6]。外泌体在生理和病理条件下均可以释放到血液中，并通过囊泡内的成分参与细胞和组织调控[18]。另外，这种含有miRNA的外泌体与AMI事件的关系也被广泛研究。Khan等[19]发现，胚胎干细胞来源的外泌体可以促进AMI小鼠的血管形成，修复心肌功能。而且，这类外泌体中富含miR-，胚胎干细胞来源的外泌体可以转运miR-，促进内皮祖细胞增殖。急性心肌梗死患者血液中的外泌体中也有miRNA。Yang等[20]报道，AMI患者血液分离得到的外泌体中富含miR-30a，参与心肌细胞缺氧后的自噬调控。

3．微囊泡：

微囊泡不同于胞内溶酶体途径，通常被蛋白质调节和分选，通过质膜脂质结构域以向外出芽的形式外排。Hunter等[21]在血浆中的微囊泡发现了miRNA，这一发现证实miRNA可以以微囊泡的形式稳定存在于循环血中。微囊泡可以使miRNA免受细胞外核糖核酸酶的破坏，促进细胞间的信息交流。然而，微囊泡是否依赖一种特定的信号方式分泌到血液中，目前仍没有定论[22]。微囊泡往往会与外泌体混一起，由于微囊泡通常较大，且与外泌体有重叠部分，所以尽管学者做了很多尝试，还是很难将微囊泡从外泌体中纯化出来，反之亦然。因此，人们研究的其实是两者的混合囊泡。

4．凋亡小体：

循环miRNA还能以凋亡小体的形式存在[23]。凋亡小体是一类大小为1~4μm的微粒，是细胞程序性死亡后的残余微粒，是凋亡的副产品。Zernecke等[23]发现，在动脉粥样硬化过程中，内皮细胞来源的凋亡小体被分泌到细胞外环境中，其内富含miR-，通过miR-引起趋化因子CXCL12产生，促进招募Sca-1+造血祖细胞，从而有利于斑块的稳定，并抑制动脉粥样硬化进展。

（二）以结合蛋白形式存在的循环miRNA

miRNA是否只以胞外囊泡的形式存在于细胞外血液中呢？这一观点被Wang等[24]否认，他们在人类纤维原细胞培养基中进行质谱检测，发现12种与蛋白质结合形式存在的胞外miRNA。研究显示，细胞外miRNA在血浆和细胞培养基中主要与Ago蛋白家族的Ago2结合，形成Ago2-miRNA复合体来避免被核糖核酸酶降解，从而稳定存在于血液中[25,26]。Turchinovich等[26,27]的研究表明，循环miRNA可以与其他Ago蛋白如Ago1结合，从而稳定存在于胞外环境中，并提出大多数循环miRNA可能是死细胞的副产品这一假说。虽然学者们认可这种形式的胞外miRNA可以稳定存在于血液中，但尚未有令人信服的证据表明，这类miRNA参与功能性转移。除了与Ago蛋白结合外，miRNA还可以与核仁磷酸蛋白1(NPM1)结合，从而免受核糖核酸酶的破坏[24]。

近几年也有文献报道，循环miRNA可以与HDL结合。在此之前，HDL一直被看作将肝外细胞内胆固醇转运到肝脏中的载体，与动脉粥样硬化的形成相关。Vickers等[28]发现HDL可以转运循环miRNA，并形成脂蛋白-miRNA复合体，从而避免被核糖核酸酶降解。他们从血浆中纯化分离得到HDL、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)和外泌体，发现三者中都含有一定量的miRNA，且三种形式结合的miRNA在同一血样中数量不同。家族性高胆固醇血症患者的血浆中，HDL结合的miRNA水平高于正常人[28]。值得注意的是，这种形式的循环miRNA可以被转运到受体细胞中，抑制mRNA的表达。靶细胞中许多被调控的基因都与脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化有关，这为将来的疾病治疗提供了新的方向[28]。之后Wagner等[29]发现，与HDL大量结合的循环miRNA与LDL结合量很少，而且在正常人与冠状动脉粥样硬化患者血液中，HDL-miRNA在两者之间的表达差异微乎其微。此外，他们还发现，与HDL结合的循环miRNA不能被转运到受体内皮细胞、平滑肌细胞和外周血单个核细胞中，这表明与脂蛋白结合的循环miRNA不能在所研究的细胞中发挥作用[29]。然而，这与Tabet等[30]的研究结果相悖，其证实HDL可以通过抑制黏附分子-1(ICAM-1)转运miR-到受体内皮细胞中，具有抗炎的可能性。与循环miRNA结合的HDL可能仅仅作为血液中运载的miRNA的载体[31]，它在不同受体细胞中的功能仍需进一步研究。与HDL结合的miRNA对于动脉粥样硬化可能有重要的作用，是目前研究的热点。

以上几种存在形式都可以使循环miRNA免受核酶的破坏，从而稳定存在于血液中。而血液中的胞外miRNA主要以哪种形式存在，当前并未有统一的答案。产生分歧的原因可能是由于循环miRNA提取方式和数据标准化处理存在差异。差速离心、纳米过滤、免疫沉淀反应和排阻色谱均可分离循环miRNA，而对于如何统一循环miRNA的标准化提取方式，还需要进一步研究。

二、循环miRNA在心肌梗死患者诊断中的参考价值

在心肌梗死的早期进行准确的诊断，对于疾病的治疗和预后都具有重要的价值。在过去的几年中，人们一直致力于寻找一种标志物，使其能够辅助心肌梗死的诊断、治疗和预后评估。目前临床上主要采用肌酸激酶、肌酸激酶同工酶（creatinekinase-MB，CK-MB）、肌红蛋白和cTn作为心肌梗死的标志物[32]，其中cTn是AMI早期诊断的"金标准"[33]。但是，这些标志物在某些情况下存在很多限制。cTn水平不仅在AMI中增加，在其他严重疾病如心力衰竭、慢性肾脏疾病、神经肌肉疾病、严重脓毒症和败血性休克中也有所增加。cTn的另一个缺陷是其时间限制，因为其只能在心脏缺血3~6h内检测到[5]。因此，临床上迫切需要一种敏感度和特异度都更强的标志物来辅助诊断心肌梗死，从而减少其死亡率。

理想的AMI诊断标志物应满足很多标准，如可以通过无创的方法方便获得、特异度高或大量存在于心脏组织中、在正常条件下循环系统中含量非常低或不可检测、AMI发生时可在短时间内从损伤的心脏释放到血液中且具有较长的半衰期以方便检测等[34]。血液中的miRNA很好地符合了理想标志物的大多数特征。循环miRNA可以稳定存在于血液中，且一些miRNA特异地存在于心脏组织。当AMI患者的心肌发生坏死时，cTn才会释放到血液中。而miRNA的释放则会受到细胞应激的影响，如缺氧、乳酸性酸中毒或细胞水肿，其发生早于AMI患者的心肌坏死[34]。cTn等蛋白质标志物所用的检测方法为免疫化学法，而低浓度的cTn往往会影响检测。另外，蛋白质生物标志物具有不同的翻译后修饰，可能会影响检测的准确性。而循环miRNA采用分子检测方法，包括Northern印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR，具有很高的精确性。Northern印迹分析和微点阵因为耗时耗量等原因，较少用于临床研究中。当前主要采用的是实时定量PCR[35]。总之，循环miRNA相较于传统蛋白质标志物具有结构简单、低复杂性、组织细胞特异性、出现更早和检测更准确等优势。事实上，已有资料表明，miRNA作为诊断疾病的标志物优于某些蛋白标志物[34]。因此，循环miRNA似乎是一种很好的早期标志物，可以辅助AMI的诊断和预后评估。目前，miR-1、miR-、miR-和miR-a/b都被看作是辅助诊断急性心肌梗死的标志物。

循环miR-1在AMI大鼠模型和AMI患者的血液中均显著增加。Cheng等[36]在AMI大鼠模型中发现，血清miR-1水平在心肌梗死发生后迅速升高约倍，6h达到顶峰，3d后回到基线水平。miR-1水平与心肌梗死面积呈正相关性(r=0.88，P0.05)。临床研究也证实，相对于健康受试者，心肌梗死发生后miR-1水平升高约倍，且与CK-MB水平呈正相关[36]。Ai等[37]也发现，循环miR-1水平在AMI患者中显著升高，给予药物治疗后其水平恢复正常。另外，miR-1水平增高与年龄、性别、血压、糖尿病均无关[37]。这些发现均表明，循环miR-1可以作为一个独立可靠的AMI诊断标志物。

miR-是由肌球蛋白重链7B(Myh7B)编码的微小RNA，几乎仅在心脏中表达。Adachi等[38]首次在急性期(胸痛48h内)AMI患者的血液中发现miR-水平显著升高，提示循环miR-可能是一个很好的AMI诊断标志物。随后，又有研究发现AMI患者血液中循环miR-水平是健康者的倍[39]。受试者工作特征(ROC)曲线显示，miR-曲线下面积为0.97，与循环cTnT相关。在AMI患者胸痛发生3h内，miR-的检测阳性率为93%,高于高敏cTnT的阳性率（88%）[40]。在老年急性非ST段抬高型心肌梗死患者血液中，miR--5p(miR-家族中成员)水平比健康受试者高80倍，ROC曲线显示miR--5p的曲线下面积高于cTnT和高敏cTnT(分别为0.86、0.68和0.70)[41]。这些研究均表明，循环miR-是一个较敏感的新型诊断标志物。

miR-包括miR-a和miR-b。在AMI小鼠模型和AMI患者血液中，miR-表达水平均高于对照组，在AMI患者发生梗死min后，其水平达到顶峰，与cTnI变化相似[42]。Eitel等[43]通过对例急性ST段抬高型心肌梗死患者研究发现，升高的miR-a水平与心肌梗死面积增大、可挽救心肌面积减少及严重的再灌注损伤有关。

miR-参与心脏肌球蛋白重链形成，其家族包括miR-a和miR-b[44]。Liu等[45]的研究发现，循环miR-的表达水平在我国汉族AMI患者中显著升高，具有很好的诊断价值。miR-a是由其宿主基因alpha-MHC编码，仅在心肌细胞中表达[44]。Wang等[46]通过microRNA芯片和实时定量PCR分析，证实miR-a在心脏中特异性表达。在大鼠实验中发现，冠状动脉阻塞后即刻检测不到miR-a，但是1h后miR-a即可显著增加。不同于miR-1、miR-和miR-在健康者血液中有轻微的表达，miR-a在健康者血液中几乎不存在，但在90.9%的AMI患者血液中均可显著增加，且在胸痛发生4h内的AMI患者中miR-a检出率为%[46]，而此时cTnI尚未升高。以上结果表明，miR-a可以在心肌受损早期释放入血液中，相较于cTnI具有早期诊断AMI的优势[46]。miR-b与miR-a具有高水平的序列相似性，位于β-MHC基因的内含子中[44]。在AMI患者中，miR-b在血液中表达增加[47]。miR-b在AMI患者血浆中比健康者增加倍，ROC曲线下面积为0.94[48]，比CK-MB和cTnI敏感度更高。另外，在发生AMI的冠状动脉三支病变患者中，miR-b水平明显高于单支或双支患者，经皮冠状动脉介入治疗后患者miR-b水平比入院前降低[49]。

除了以上这些当前比较公认的标志物外，近年也有一些新的miRNA在AMI患者血液中被检测出来，如miR-a[50]、miR--3p[51]、miR-和miR-[52]等。尽管越来越多的血液中miRNA被报道可作为AMI的诊断标志物，但目前最公认的还是上述4种miRNA，即心脏富含的miR-和miR-1，以及心脏特异性的miR-和miR-。而miR-和miR-由于有心脏特异性，其诊断AMI的敏感度和特异度可能优于miR-和miR-1。Li等[53]对这4个循环miRNA进行比较，结果显示miR-是一个更可靠的AMI诊断标志物。但是，这些研究的样本量较少，结论还需要进一步验证。

虽然研究表明循环miRNA作为AMI的诊断标志物具有很多优点，如稳定性好、检测手段简单、比cTn更早释放入血等，但其也存在一些不足。首先，循环miRNA的检测方法比CK-MB和cTn耗时长。当前临床检测miRNA主要是实时定量PCR，还没有常规简便的方法。尽管如此，高敏感且快捷的miRNA检测方法一直是当前研究的热点。事实上，像酶联免疫吸附测定(ELISA)这类检测方法正被研究应用于miRNA的检测。相信不久的将来，研究者就可以解决这类技术问题。第二是心肌梗死初期的血液样本较难获得,这样就无法准确监测心肌梗死初期循环miRNA的水平变化。对此,可以进行相关的统计分析如荟萃分析，从而更加准确地探究循环miRNA对AMI的早期诊断价值。第三是绝对特异性的限制。如上述提到的miR-1和miR-虽然在心肌细胞中含量丰富，且AMI发生时可显著增加，但这些循环miRNA在骨骼肌中也表达。当骨骼肌损伤时，其在血液中的水平也会增加，因此在筛选出更特异的循环miRNA来辅助AMI诊断的同时，需要改进下游分析技术，如数字化PCR和下代测序都有望提高循环miRNA的诊断价值。目前有大量研究证实在心肌损伤时，miRNA比cTnI和T更早释放到血液中，这一现象吸引着学者们对循环miRNA进行深入的研究。

三、总结

近几年，胞外miRNA被发现存在于各种体液中，尤其是血液。miRNA的组织和细胞特异性使其可以被用作组织和细胞鉴定的生物标志物。然而，在大多数疾病状况下，病变组织往往难以获得，但是miRNA可以从组织释放到血液中。循环miRNA特有的胞外存在形式使其稳定存在于血液中，而不被核糖核酸酶降解。稳定性是其能够成为疾病理想诊断标志物的重要原因。

寻找包括AMI在内的心血管疾病的最佳诊断标志物是研究的热门领域，以往的循环标志物均是肽和蛋白，检测方法主要是生物化学和免疫方法。分子生物学的发展吸引研究者们将研究方向转移到核苷酸标志物，通过分子手段增强诊断的精准性。AMI的理想核苷酸血液生物标志物应该是优先在心脏中产生，并且在健康者血液中以低浓度存在。在AMI发生时，这些核苷酸被释放到血液液中，能相对稳定存在，并通过分子技术快速精确检测，而循环miRNA完美地符合上述要求。使用循环miRNA作为AMI诊断生物标志物可能代表了现代心脏病学的新方向，也为AMI的发生机制提供了研究的新思路。循环miRNA的特征和功能仍存在着很多未解之谜，需要学者们进一步探索。尽管目前存在一些对循环miRNA的质疑，但不能否认其在疾病诊断中的参考价值。

参考文献（略）

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