王玥　岳维　李兔平　高盼　易剑敏　张伟男

太原，山西医科大学麻醉系（王玥、李兔平、高盼、易剑敏、张伟男）；太原，医院麻醉科（岳维）

国际麻醉学与复苏杂志,,39(06):-.

DOI：10./cma.j.issn.-..06.

基金项目

国家自然科学基金青年基金（）；教育部高等学校博士点专项科研基金（20131417120）；山西省教育厅高等学校科技创新项目（）

ORIGINALARTICLES

本研究旨在评估心肌点注射法慢病毒（Lv）介导降钙素基因相关肽（CGRP）基因转导的可行性及此法对糖尿病心肌在遭受缺血/再灌注（I/R）损伤时是否具有保护作用。

1　材料与方法

将60只~g健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为5组（每组12只）：对照组（C组）、糖尿病组（DM组）、心肌注射手术组（Sham组）、心肌注射对照组（MC组）、心脏转导组（ME组）。采用心肌点注射法将Sham组、MC组、ME组大鼠在体分别注射生理盐水、滴度2×病毒基因组（vg）/ml的携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的慢病毒（Lv-eGFP）及携带CGRP基因的Lv-eGFP（Lv-CGRP-eGFP）各50μl。转染1周后DM组、Sham组、MC组、ME组行链脲佐菌素（STZ）50mg/kg腹腔注射，建立糖尿病模型。注射STZ8周后采用冠状动脉左前降支结扎法制备心脏I/R模型。比较各组大鼠甩尾反射潜伏期，心肌、脊髓、背根神经节（DRG）组织中eGFP表达情况、CGRP基因转录水平、CGRP蛋白表达含量，心肌缺血危险区面积（AAR）及梗死区面积（IS）。

2　结　果

2.1　大鼠生存状况

DM组及ME组各有1只大鼠死亡，大鼠死亡率组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2　大鼠甩尾反射潜伏期

与C组比较，DM组、Sham组、MC组、ME组大鼠自糖尿病造模成功4周末开始甩尾反射潜伏期明显延长（P0.05，表1）。

2.3　大鼠各组织eGFP的表达

荧光显微镜下可见大鼠标本自发微弱绿色荧

光（图1显示为灰色）；心肌纤维排列整齐，局限在左心室心肌注射部位可见大量绿色荧光（图1A显示为白色）；脊髓灰质及背根神经节（DRG）可见散在绿色荧光（图1B、C显示为白色）。

2.4　CGRP基因在各组织转录情况

经实时荧光定量聚合酶链式反应（real-timefqPCR）法测定各组标本CGRP基因荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（CT），转录结果以2-ΔΔCT表示（图2）。

与DM组、Sham组、MC组比较，C组及ME组缺血区心肌组织、T1~T5脊髓、T1~T5DRG中CGRP转录水平上升（P0.05），DM组、Sham组、MC组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与C组比较，ME组缺血区心肌组织、T1~T5DRG中CGRP转录水平上升（P0.05），T1~T5脊髓中CGRP转录水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5　CGRP蛋白在各组织表达情况

与DM组、Sham组、MC组比较，C组、ME组大鼠缺血区心肌组织、T1~T5脊髓、T1~T5DRG及血清内CGRP蛋白含量较高（P0.05），DM组、Sham组、MC组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与C组比较，ME组心肌缺血区CGRP蛋白含量升高（P0.05），T1~T5脊髓CGRP蛋白含量降低，差异有统计学意义（P0.05），T1~T5DRG及血清中CGRP蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.6　I/R后心肌损伤情况

TTC染色显示，正常左心室心肌染为蓝色（图3中显示为黑色），AAR为红色（图3中显示为灰色），IS为白色（图3中显示为灰白色）。各组AAR/LV比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；DM组、Sham组、MC组IS/AAR高于C组、ME组（P＜0.05），ME组IS/AAR高于C组（P＜0.05）。DM组、Sham组、MC组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

3　讨　论

本研究应用Lv为载体，通过Lv-CGRP心肌注射将CGRP基因整合入大鼠体内，再经腹腔注射STZ，制造心脏CGRP基因表达增高的糖尿病大鼠模型。甩尾反射潜伏期结果提示，随病程延长糖尿病大鼠出现感觉神经退化，并不能证实经心肌局部转染感觉神经肽CGRP基因可以延缓外周感觉神经退化。CGRP在各组织转录比较结果提示，CGRP基因转导可使缺血区心肌组织和T1~T5DRGCGRP表达明显升高。I/R后心肌损伤情况提示，ME组IS/AAR低于DM组、Sham组、MC组。

上述研究结果表明，CGRP基因高表达的糖尿病大鼠发生心肌缺血时其适应及抵抗能力明显增强。real-timefqPCR及ELISA结果一致显示，经心肌点注射法转导CGRP基因的心肌组织及其所属T1~T5脊髓节段及DRG中CGRP含量均高于DM组、Sham组、MC组大鼠，可在一定程度上佐证增加心脏感觉神经递质能对DRG神经元的生长及其物质表达具有促进作用，为进一步研究增加心脏感觉神经递质可逆向作用于中枢神经系统提供理论支持。

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