01

研究背景

在氧化应激条件下，Neddylation对心肌细胞的存活至关重要，并参与自噬调节。但是，Neddylation抑制剂MLN是否对心肌缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）具有心脏保护作用尚不清楚。

本研究中发现MLN具有明显的心脏保护作用，具体表现为，在体外H2O2诱导损伤后，MLN使细胞活力显著提高，LDH漏出率降低，细胞形态改善。与MI/R小鼠相比，MLN还显著降低了血清心肌酶谱水平，改善了心脏组织病理学改变，减轻了左心室收缩功能障碍，从而降低了体内心肌梗死面积。

但研究发现，MLN的这种作用被自噬流（autophagicflux）抑制剂Chloroquine的联合治疗所消除。mRFP-GFP-LC3分析表明，MLN通过增强自身溶酶体的形成来恢复有缺陷的自噬流。用MLN处理经过H2O2诱导损伤的细胞或MI/R小鼠，可以发现离体和活体的Rab7和Atg5的表达水平显著上调，而在Sirt1敲除的细胞和心脏组织中则很大程度上阻断了这种效应。

综上所述，MLN在体外和MI/R小鼠中通过恢复受损的自噬流而表现出明显的心脏保护作用。本研究表明，Sirt1可能通过上调MI/R中的Rab7而在自噬体清除中

起着关键作用。

02

实验方法

1.动物模型

雄性C57/BL-6小鼠，体重20–25g，6只/笼进行实验。小鼠通过吸入2–3%异氟醚进行麻醉。此后，进行左胸手术，结扎左前降支（leftanteriordescending，LAD）30分钟（假手术组不结扎），然后再灌注24小时。将MLN（3或6mg/kg）溶解在含有0.01%DMSO的生理盐水（normalsaline，NS）中，在MI/R手术前，每天皮下注射一次，持续7天。在对照组中给予相同量的0.01%DMSO的NS作为溶剂对照。

2.超声心动图

在MI/R损伤后24小时，通过FUJIFILMVisualSonics超声系统和MS-成像探头评估心脏结构和功能。在麻醉下，对小鼠采集长轴图像以测量舒张末期和收缩末期容积。超声系统自动计算并记录左室射血分数（EF，%）和缩短分数（FS，%）。通过计算五个心动周期的平均值来评估每个参数。

03

实验结果

MLN在体内通过Sirt1改善MI/R损伤

为了证实Sirt1在MLN对心脏保护的作用，通过心肌内注射Ad.Sirt1-AS进行实验。实验结果发现，与假手术组相比，MI/R组在再灌注24h时通过心电图观察到ST段显著升高（图1A），而ML（low-dosageofMLN，3mg/kg）和MH（high-dosageofMLN，6mg/kg）不同程度地降低了ST段升高。然而，Ad.Sirt1-AS对Sir1的下调，显著逆转了MLN对ST段升高的作用。此外，MI/R组心肌梗死明显增加（70.6%）。

与MI/R组相比，ML（3mg/kg）和MH（6mg/kg）将梗死面积减小至55%和44.1%（图1B-D）。然而，Sirt1的下调使梗死面积（69.2%）显著逆转，至MI/R组的水平（图1B）。

此外，在MI/R后24小时，观察到MI/R动物的心功能受损，如图1E所示，与假手术组相比，EF（39.4%，图1F）和FS（18.9%，图1G）分别显著降低。然而，使用ML和MH治疗后EF%（59.3%和71.8%）和FS%（31.7%和42.2%）显著改善。Sirt1的下调显著降低了MLN对EF%和FS%的保护作用。

图1.MLN对MI/R小鼠心电图改变和心功能改善作用与Sirt1相关。心肌内注射Ad.Sirt1-AS3天后，所有小鼠分为假手术，MI/R、ML（3mg/kg）+MI/R、MH（6mg/kg）+MI/R、Ad.Sirt1-AS+MH（6mg/kg）+MI/R组。（A）小鼠MI/R损伤24小时后进行心电图（ECG）采集（50ms/div）。检测各组心肌梗死面积（I，bar=10mm）（B）、风险区域面积与心肌的比值（C）和梗死面积与风险区域面积的比值（D）。此外，与假手术动物相比，MI/R小鼠表现出显著的左心室功能降低，如室壁运动的M-Mode图像所示（E）。MLN治疗显著改善心脏功能。射血分数EF（F）。缩短分数FS（G）。数据以mean±S.D.表示（n=5）。与假手术组相比，#P0.05。与MI/R组相比，*P0.05。

04

实验结论

本研究首次强调MLN是MI/R心肌细胞存活的关键心脏保护剂。通过使用体外和体内心肌损伤模型，证明了Sirt1是MLN造成心脏自噬流增强的关键因素。此外，研究者还发现了MI/R应激下新的Sirt1/Rab7自噬流调节途径。

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