张登文1龙瑞春1刘莹珠1何毅2孙怡1夏正远3王晟1,2

1医院，广东省医学科学院麻醉科，广州；2医院，广东省心血管病研究所麻醉科，广州；3香港大学麻醉系,香港

国际麻醉学与复苏杂志,,41(03):-.

DOI：10./cma.j.issn.-..03.

基金项目

广东省自然科学基金

（A，A）；

国家重点研发计划（YFC）

ORIGINALARTICLES

本研究拟通过对H9C2心肌细胞实施缺氧复氧（HR）性损伤，观察凋亡、自噬、焦亡3种细胞死亡方式的变化，探讨三者在H9C2心肌细胞HR性损伤中的作用。

1材料和方法

1.1　细胞及试剂

H9C2心肌细胞由香港大学李嘉诚医学院麻醉实验室赠送。半胱氨酸蛋白酶（caspase）?3、B细胞淋巴瘤/白血病（Bcl）相关蛋白（Bax）、Bcl?2、β?actin、轻链蛋白3（LC3）Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin?1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p?mTOR）抗体。IL?1β、IL?18、Nod样受体蛋白?3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体。半胱氨酸蛋白酶?1p20（caspase?1p20）抗体。

1.2　细胞培养与分组

于37℃、5％CO2细胞培养箱中，采用含有10%的胎牛血清、1%的双抗（青霉素?链霉素）改良Eagle培养基（DMEM）培养基培养H9C2心肌细胞。

1.3　细胞HR模型

去除H9C2心肌细胞中的培养基，杜氏磷酸缓冲液（DPBS）清洗后换用不含胎牛血清的无糖DMEM培养基，放入缺氧培养箱（37℃、5％CO2、95%N2）中培养8h,复氧时换用正常培养基培养12h。

1.4　细胞活力和乳酸脱氢酶（LDH）含量的检测

将H9C2心肌细胞以5×个/ml的密度接种于96孔培养板，μl/孔。采用随机数字表法分为两组（每组6孔）：正常对照组（Ctrl组）和HR组（按1.3制备HR模型）。细胞模拟缺血/再灌注后4h，吸出细胞培养液，用无菌PBS清洗3次；每孔内加入μlDMEM和10μl的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法试剂，以避免加样时产生气泡影响读数；将培养板继续在37℃、5%CO2孵箱中孵育2h；酶标仪nm波长测定样品吸光度值。认定Ctrl组细胞活力为%，HR组的吸光度值为Ctrl组的相对值。LDH含量的检测按LDH检测试剂盒说明书操作进行。

1.5　Westernblot检测

将H9C2心肌细胞调至合适密度（2×个/ml）接种于6孔培养板，2ml/孔，每组9孔。分组及处理方式同上。去除细胞培养液，DPBS漂洗3次，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，?80°C反复冻融后，收集裂解液g、4℃离心20min，取上清液用BCA法测定蛋白样品浓度。将50μg的蛋白用5%的浓缩胶及10%或7%的分离胶进行电泳后转移至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温下封闭1h，一抗（1∶0）4℃孵育过夜，洗膜后辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶）室温孵育1h。漂洗后加入化学发光试剂，用胶片曝光显影后，扫描分析。

1.6　免疫荧光检测及TUNEL染色

将H9C2心肌细胞以1×个/ml的密度接种于预先放置有无菌盖玻片的12孔培养板中，1ml/孔，每组6孔。分组及处理方式同上。处理各组细胞后，除去细胞培养液，DPBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min。PBS漂洗5min×3次，山羊血清封闭15min后加入兔抗大鼠LC3（1∶），4°C过夜。PBS漂洗5min×3次，加入AlexaFluor?Plus标记的驴抗兔二抗（1∶）孵育1h，PBS漂洗5min×3次，用含有4，6二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）核染料的封片剂进行封片。荧光显微镜下观察。TUNEL染色按试剂盒说明书进行。

1.7　统计学分析

采用GraphPadPrism7.0统计学软件对数据进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　HR后H9C2心肌细胞损伤情况

与Ctrl组比较，HR组LDH释放增加（P0.05，图1?），H9C2心肌细胞的活力下降（P0.05，图1?），细胞损伤增加，说明细胞HR模型成功。

2.2　HR对H9C2心肌细胞凋亡的影响

与Ctrl组比较，HR组细胞凋亡相关蛋白活化的caspase?3表达增加（P0.05，图2?），Bcl?2/Bax降低（P0.05，图2?）。TUNEL染色也发现HR组细胞凋亡增加（P0.05，图3）。

2.3　HR对H9C2心肌细胞自噬的影响

与Ctrl组比较，HR组H9C2心肌细胞自噬的相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ（P0.05，图4?）和Beclin?1（P0.05，图4?）降低，p62（P0.05，图4?）、p?mTOR（P0.05，图4?）表达增加，差异有统计学意义。

HR组H9C2心肌细胞中LC3Ⅱ荧光染色增加（图5）。结果提示缺氧8h复氧12h后H9C2心肌细胞自噬小体增加，但其清除功能受损，即自噬功能受损。

2.4　HR对H9C2心肌细胞焦亡的影响

复氧12h后细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、活化的caspase?1p20表达上调（P0.05，图6?、?、?），炎症因子IL?1β、IL?18表达增加（P0.05，图6?、?）。

3讨论

本研究通过对H9C2心肌细胞进行HR模拟心肌缺血/再灌注损伤，在离体细胞水平探讨3种细胞死亡方式在心肌缺血/再灌注损伤中的作用。本研究结果显示，HR后，H9C2心肌细胞活力下降、LDH释放增加，缺氧8h复氧12h后心肌细胞损伤增加，这说明HR模型成功。

本研究结果发现，HR后H9C2心肌细胞中凋亡相关蛋白活化的caspase?3表达增加，Bcl?2/Bax降低，TUNEL染色也发现HR组细胞凋亡增加。细胞凋亡参与了心肌缺血/再灌注损伤，并起着重要的作用。

本研究发现，HR后H9C2心肌细胞中NLRP3、ASC、活化的caspase?1表达增加，炎症因子IL?1β、IL?18表达增加，TUNEL染色阳性细胞增加,说明HR后H9C2心肌细胞焦亡增加。HR损伤可使H9C2心肌细胞产生大量的活性氧（ROS），ROS可进一步激活NLRP3炎性小体，进而导致细胞焦亡。

本研究结果显示，缺氧8h复氧12h后心肌细胞p?mTOR、p62、Beclin?1蛋白均表达增加，但LC3Ⅱ/Ⅰ降低，LC3免疫荧光染色显示HR后细胞内的自噬小体增加，表明HR后自噬小体清除受损，即自噬功能被抑制。自噬被抑制导致ROS等无法被清除，而ROS可诱导细胞凋亡和活化NLRP3及其介导的细胞焦亡，这可能是本研究中观察到H9C2心肌细胞在HR性损伤过程中NLRP3炎性小体活化、细胞焦亡及凋亡增加的原因。

也有研究认为抑制细胞自噬可以对心肌产生保护作用。自噬在心肌缺血/再灌注损伤过程中可能发挥不同的作用，在缺血期间激活自噬可以减轻缺血/再灌注损伤，而在再灌注期间，自噬过度激活可加重再灌注损伤。这与本研究结果不一致的原因可能是由于本研究中HR的时间不同，大部分研究中的HR模型为缺氧4~6h复氧4~6h，而本研究中采用的时缺氧8h，复氧12h。这也提示在HR过程中细胞自噬可能存在一个动态的变化过程，其具体变化趋势还待进一步的研究。

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