李瑞萍　薛富善　杨桂珍　刘亚洋　李慧娴　廖旭

中国医学科学院，北京协和医学院，医院麻醉科；2首都医科医院麻醉科

国际麻醉学与复苏杂志,,40(02):98-.

DOI：10./cma.j.issn.-..02.

基金项目

国家自然科学基金（，81479）

ORIGINALARTICLES

本研究拟评价微小RNA（miRNA）-30c-2-3p调控内质网相关XBP1s［内质网应激后，X-box结合蛋白-1（XBP1）剪接后翻译成具有转录调节活性的XBP1］在IPC对心肌缺氧/复氧损伤保护中的作用。

1　材料与方法

1.1　心肌细胞培养

本实验选取出生1~2dSPF级大鼠，采用75%乙醇皮肤消毒后，开胸剪下心脏，剔除心包、心房和大血管等，去除残血，将心肌剪成约1mm3的碎块，采用0.%不含乙二胺四乙酸的胰酶复合0.1%Ⅰ型胶原酶混合多次消化，目筛网过滤获取乳鼠心肌细胞，差速贴壁70min并结合5-BrdU化学抑制法提纯心肌细胞，培养细胞隔天换液。原代心肌细胞采用含10%胎牛血清的高糖培养基培养。

1.2　心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的制备

参照文献介绍的方法，并加以改进构建心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。心肌细胞培养72h后，替换不含血清的低糖培养基，并置于厌氧培养袋中（内含厌氧产气袋和氧含量指示条），充入纯氮气2min，迅速密封厌氧袋，构建缺氧环境（O2%1%）。缺氧3h后，更换为含10%胎牛血清的高糖培养基，置于37℃、95%空气-5%CO2无菌培养箱中继续培养6h。

1.3　心肌细胞缺氧预处理

根据预实验的结果，将心肌细胞培养72h后，替换不含血清的低糖培养基，并置于厌氧培养袋中（内含厌氧产气袋和氧含量指示条），充入纯氮气2min，迅速密封厌氧袋，构建缺氧环境（O2%1%）。缺氧30min后，更换为含10%胎牛血清的高糖培养基，置于37℃、95%空气-5%CO2无菌培养箱中继续培养30min。

1.4　实验分组

选取接种24h生长状态较好的心肌细胞，随机分成3组（每组72个培养孔）：对照组（Sham组）、缺氧/复氧组（AR组）和缺氧预处理组（PAR组）。Sham组心肌细胞正常培养；AR组心肌细胞进行缺氧3h/复氧6h处理；PAR组心肌细胞在进行缺氧3h/复氧6h处理前实施单循环的缺氧预处理，即缺氧30min/复氧30min。各组细胞分别处理后（即复氧6h后）进行检测。

1.5　检测项目

1.5.1　心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）漏出率的检测

采用比色法检测心肌细胞培养液和细胞内LDH的活性，具体步骤参照碧云天生物技术研究所提供的试剂盒说明书。每组取6个培养孔（重复3次），同时设定空白对照孔，使用全自动多功能酶标仪，于波长nm处测定培养液、心肌细胞以及空白对照孔的光密度（D）值，根据以下公式计算出心肌细胞LDH漏出率，LDH漏出率=（培养液上清D值－对照孔D值）/（培养液上清D值－对照孔D值＋心肌细胞D值－对照孔D值）×%。

1.5.2　心肌细胞凋亡检测

采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡率和存活率，具体操作步骤参照检测说明书。每组取6个培养孔（重复3次），相应处理后，使用0.25％胰蛋白酶收集心肌细胞，计数并离心5min，弃上清液，用1×AnnexinBindingbuffer重悬细胞，调整细胞密度约为1×个/ml。取1ml细胞悬液，加入AnnexinV50μl，避光室温孵育15min。上机检测前，加入PI工作液1μl。采用FACSCalibur型流式细胞仪进行检测，选用Summit5.0分析软件进行分析，流式细胞仪的散点图上，左下象限显示为正常活细胞，右下象限表示早期凋亡细胞，右上象限表示晚期凋亡细胞，左上象限表示非特异性损伤。

1.5.3　miRNA-30c-2-3p和XBP1mRNA检测

采用miRNAVanaTMmiRNAIsolationKit试剂盒提取包含miRNA的总RNA，采用TaqManRmiRNATranscription进行miRNA逆转录，聚合酶链式反应扩增所需miRNA-30c-2-3p引物及内参基因U6引物购自于美国LifeTechnologies公司，具体步骤参照试剂盒说明书。每组取6个培养孔，重复3次。采用Trizol试剂盒提取血清总RNA，使用分光光度计测总RNA浓度，将提取的总RNA反转录合成cDNA，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成，XBP1的上游引物为GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物为CATCTGCTGGAAGGTGGACA；内参β-actin上游引物为CTGAGTCCGCAGCAGGTG，下游引物为GACAGGGTCCAACTTGTCCA。

20μl反应体系包括总RNA样本和DEPC水11μl、Olig（dT）1μl、5×逆转录缓冲液5μl、dNTP1μl、M-MLV1μl、DEPC水2μl。反应条件为42℃60min，70℃15min。合成的cDNA于-20℃保存备用。实时荧光定量PCR（real-timePCR）反应体系20μl包括cDNA2μl，上游引物、下游引物各0.6μl，DEPC水6.8μl，SYBRGreenMasterMix10μl；扩增条件为95℃预变性，95℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸45s，共40个循环。在real-timePCR仪上进行反应，反应结束后，软件自动记录荧光曲线并计算出Ct值。以β-actin作为内参，每份样本的XBP1基因和β-actin基因均重复2孔。

1.5.4　XBP1s和免疫球蛋白结合蛋白（BiP）的检测

各组处理后，相同时间点进行检测，每组取6个培养孔，重复3次。抽提心肌细胞总蛋白，-80℃保存待集中检测。采用BCA法检测各样品蛋白含量。各组取蛋白样品μg进行SDS-PAGE（10％分离胶，5％浓缩胶），将电泳后分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。经封闭、洗脱后分别加入稀释的一抗［anti-XBP1s稀释度1∶0，anti-BiP（BiP抗体）稀释度1∶0，anti-βactin（β-actin抗体）稀释度1∶0，CellSignaling公司，美国］，4℃孵育，摇床过夜。洗膜后加入1∶00稀释的辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记二抗，室温孵育1h。显色曝光采用增强化学发光法，暗室胶片曝光，曝光及显影、定影时间视蛋白条带的深浅而定。将获得的胶片用扫描仪扫描并保存为.TIF文件，采用QuantityOne分析软件获取图片上目标特异条带灰度值后进行分析。

1.5.5　双荧光素酶基因检测

具体操作由广州辉骏生物科技有限公司完成，采用psiCHECKTM-2质粒作为载体，分别构建psiCHECKTM-2-XBP1-3′UTR野生型和突变型报告基因载体，将miRNA-30c-2-3pmimics、阴性对照mimics分别与两个载体共转染H9c2大鼠胚胎心肌细胞，最终根据荧光素信号的强弱判断miRAN-30c-2-3p是否能抑制XBP1的表达，即明确XBP1是miRAN-30c-2-3p的靶基因。

2　结　果

与Sham组比较，AR组和PAR组心肌细胞LDH漏出率升高，正常心肌细胞比例降低，凋亡细胞比例升高（P0.05），心肌细胞miRNA-30c-2-3p、XBP1mRNA和XBP1s、BiP表达上调（P0.05）。与AR组比较，PAR组心肌细胞LDH漏出率降低，正常心肌细胞百分比升高，凋亡细胞百分比降低，miRNA-30c-2-3p表达下调，XBP1mRNA和XBP1s、BiP表达升高（P0.05，表1~表3）。

双荧光素酶基因报告结果显示，与转染了NCmimics的Sham组比较，转染miRNA-30c-2-3pmimics后，携带有XBP1突变型报告基因载体组荧光素酶信号强度没有明显变化，而携带XBP1野生型报告基因载体组的荧光素酶信号强度发生明显降低，表明XBP1基因是miRNA-30c-2-3p的靶基因。

3　讨　论

本实验研究结果显示，与Sham组比较，各组LDH漏出率明显增高，说明缺氧对心肌细胞造成了损伤。当进行缺氧30min/复氧30min的预处理后再进行3h缺氧/6h复氧处理（PAR组）时，与AR组比较，LDH漏出率降低约10%，凋亡细胞比例明显减少，证明缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤产生了明显的保护作用，提示缺氧预处理模型构建成功。与AR组比较，PAR组miRNA-30c-2-3p心肌表达明显降低，而细胞损伤明显减轻，提示miRNA-30c-2-3p减少可能是缺氧预处理产生心肌保护作用的机制之一。

本实验检测了缺氧预处理和缺氧/复氧损伤中miRNA-30c-2-3p、XBP1及XBP1s的表达，结果表明在缺氧/复氧损伤中，三者表达均明显增加，而在缺氧预处理过程中，miRNA-30c-2-3p表达减少，XBP1和XBP1s表达增加；从而可推测三者均参与了缺氧/复氧损伤和缺氧预处理过程，miRNA-30c-2-3p对XBP1的调控在缺氧预处理中起到一定的作用。另外，荧光素酶基因报告结果证实XBP1基因是miRNA-30c-2-3p的靶基因，再次验证两者存在的靶向调控关系。

3组中BiP表达趋势与XBP1一致，由于实验缺乏反向验证，我们只能推测BiP可能是XBP1的下游因子之一，尚需进一步的实验验证。

如果您对本文感兴趣，可登录我刊投稿系统平台（

转载请注明:http://www.qolku.com//mjcczl/12539.html