Hypoxia-elicitedmesenchymalstemcell-derivedexosomesfacilitatescardiacrepairthroughmiR-bmediatedpreventionofcelldeathinmyocardialinfarction

摘要：缺氧条件下骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对缺血性疾病具有保护作用。然而，外泌体miRNA在低氧条件下的作用尚不明确，且组织靶向的特异性较差，限制了其临床应用。因此，本研究的目的是探讨miRNA在低表达状态下对缺血心肌修复的作用及其机制。我们进一步开发了对心肌具有高特异性的改良型外泌体，并对其治疗效果进行了评价。

方法：对小鼠骨髓间充质干细胞进行缺氧或常压培养，收集细胞外泌体。采用低氧或常氧条件下的外泌体给药于永久性心肌梗死(MI)小鼠。28天后，分别用三色染色法和超声心动图比较低氧外渗和去氧外渗处理心肌梗死小鼠的心肌梗死面积和心肌输出量，以评价低氧外渗和去氧外渗处理心肌梗死小鼠的治疗效果。我们利用miRNA阵列来识别表达差异显著的miRNA。我们在小鼠心肌梗死模型中进行心肌内注射候选miRNA-knockdown外泌体，观察候选miRNA靶细胞表达量和心功能的变化。我们采用生物正交实验法，将低氧外泌体与缺血心肌靶向肽(IMT)结合，并通过对MI小鼠的全身给药，检测其靶向特异性和治疗效果。

结果：miRNA芯片显示miR-b-5p在低表达组中较低表达组明显富集。给予miR-b敲低低氧外渗可显著增加心肌梗死面积，抑制心肌梗死后心肌细胞存活。在机制上，miR-b敲低的低氧外泌体丧失了抑制心肌细胞中促凋亡基因p53和BAK1表达的能力。静脉注射(IMT-Exo)对心肌缺血损伤具有特异性靶向性，对心肌梗死后的心肌保护作用显著。

结论：我们的研究结果阐明了低外源性miR-b-5p通过改善心肌细胞凋亡促进缺血心肌修复的新机制。此外，我们的IMTExo可能作为一种新的药物载体，提高了缺血性疾病药物传递的特异性。

结果：

图1.外泌体的表征。(A)低氧外泌体和常氧外泌体的透射电镜图。(B)具有代表性的光散射显微镜图像。(C)基于LSM图像的外泌体的尺寸分布。(D)Westernblot分析外泌体中Alix和TSG的表达情况。采用超离心分离上清液作为阴性对照。

图2.低氧外泌体移植小鼠心肌梗死后心功能增强。(A)心内注射示意图。(B)假手术、PBS、低氧外泌体或常氧外泌体处理心肌梗死小鼠28天时，Masson染色心肌切片。蓝色和红色分别表示瘢痕组织和存活心肌。(C-D)假手术组、PBS治疗组、低氧外泌体治疗组和常氧外泌体治疗组小鼠心肌梗死后28天超声心动图。

图3.低氧外泌体或常氧外泌体中上调miRNA的分析和鉴定。(A)12个上调miRNA的热点图和分级聚类，其常氧外泌体和低氧外泌体之间的差异≥3倍。(B)RT-PCR比较3个独立实验中，mir-、、、b、、、a、6、92a、、、与低氧外泌体的差异。

图4.miR-b在低氧外泌体中的抑制作用增加心肌梗死小鼠模型的梗死面积。(A)RT-PCR检测miR-b-5p在BMSCs或miR-b-5pinhibitor或阴性对照(NC)处理的MSCs缺氧培养基中分离的Exo中表达。(B)左前降支结扎术后局部注射mirb-sub-exo或nc-sub-exo后缺血心肌组织中miR-b的表达。(C)有代表性的Masson染色图像和mirbkd-sub-exo或nc-sub-exo给药小鼠梗死区域的统计分析。(D)心肌梗死后28天，超声心动图检测bkd-低氧处理组和nc-低氧处理组小鼠EF%、FS%、ESCV和LVID的定量。(E)mirbkd-sub-exo或nc-sub-exo治疗心脏缺血区TUNEL(绿色)的代表性免疫荧光染色及定量。结扎28天后进行评估。

图5.miRbkd-sub-exo对H9C2细胞凋亡、增殖及其靶细胞表达水平的影响。(A-B)流式细胞术和CCK8法检测mirbkd-sub-exo对H9C2细胞凋亡(A)和增殖(B)的影响。(C-D)体外miR-b对mir-bkd-sub-exo或nc-sub-exo处理的H9C2细胞中p53、BAK1mRNA(C)和蛋白(D)表达的影响。(E)体外miR-b对mir-bkd-sub-exo或nc-sub-exo治疗心脏缺血区p53和BAK1mRNA表达的影响。

图6.低氧外泌体的靶向性表征。(A)“CSTSMLKAC”肽(IMT肽)与Cy5.5荧光团通过两步反应结合到外体胺基的示意图。(B)NTA测量未修饰的外泌体和IMT修饰后后外泌体的尺寸分布。(C)未经修饰的sub-exo或Cy5.5-IMT-Exo荧光图像。红色,Cy5.5。

图7.IMT-Exo靶向缺血心脏受累区域的能力。(A)靶向Exo静脉注射在心肌梗死小鼠模型中的示意图。Exo给药24小时后解剖心脏。(C)病灶区域相对荧光强度的量化。(D)具有代表性的小鼠器官活体解剖图像，这些器官来自于心肌梗死后给予Cy5.5、Cy5.5-exo、Cy5.5-scr或Cy5.5-imt-exo的小鼠。给药24小时后解剖器官。(E)各器官荧光强度的定量。(F)静脉注射常氧外泌体或IMT-Exo后24小时心肌梗死的荧光图像。箭头显示了一些Exo(绿色)和心肌细胞(红色)的共域化。(G)给药后LV与RV的荧光强度比值。

图8.IMT-Exo在体内和体外细胞定位的评价。(A-B)cy5.5-scr-exo或Cy5.5-IMT-Exo处理缺氧损伤H9C2细胞的荧光图像(A)和柱状图(B)。(C-D)IMT-Exo的柱状图(C)和共域图(D)。