过度自噬介导心肌肥厚心功能不全

桂亚利　余鹏　张阳阳　涂飞　吴军　刘莉　丁正年

10./j.issn.-..05.　

基金项目：国家自然科学基金项目()

作者单位：江苏省南京市，南京医院麻醉科(桂亚利，丁正年)；老年心血管病科(余鹏，张阳阳，涂飞，吴军，刘莉)

通讯作者：丁正年，Email：zhengnianding

njmu.edu.cn

心肌肥厚是心脏对血流超负荷的一种代偿反应，早期阶段心肌细胞体积增大、肌节增多，心功能代偿性增强，进一步发展为病理性心肌肥厚，心脏纤维化增加、心肌细胞能量代谢紊乱、心肌细胞坏死或凋亡，心功能失代偿，最终转化为心力衰竭(心衰)。病理性心肌肥厚作为心衰的前驱病变，是多种心血管疾病的独立危险因子。心肌组织内ATP合成减少有效促进自噬活性升高，持续的自噬激活进一步加重线粒体损伤，从而导致心脏结构和功能异常。但自噬在心肌肥厚失代偿阶段的作用尚有待阐明。本研究拟采用前期构建的心肌肥厚心功能失代偿的热休克蛋白27转基因鼠(Hsp27Tg)模型，观察自噬抑制剂渥曼青霉素(wortmannin，WM)对心功能不全发生发展的影响，探索自噬在病理性心肌肥厚失代偿阶段中的作用。

　材料与方法

实验动物与试剂　本实验所用Hsp27Tg雌鼠和性别匹配的同背景野生型(wildtype，WT)鼠均由南京大学模式动物研究所提供，并饲养于模式所内SPF级动物房。自噬相关蛋白LC3和p62单克隆抗体购自美国CellSignalingTechnology公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和马抗兔IgG购自美国Vector公司。

分组和给药方式　将4周龄的Hsp27Tg鼠分为2组：(1)WM组：WM先溶于DMSO，使用时用0.9%NaCl稀释，每天早晨9点进行腹腔注射WM(1mg/kg)；(2)溶剂组：取等体积DMS溶剂进行腹腔注射。连续给药3周后断颈处死动物后，迅速镊取心脏置于冰的磷酸盐缓冲液中，快速去除心腔中血液和心房，用干净滤纸吸干水分后放置于－80℃冰箱中保存。

心肌肥厚检测　各组小鼠称量体质量后，迅速处死后直接取出心脏称量心脏质量并通过游标卡尺测定胫骨长度，然后计算各组心脏质量/体质量比值(heatweight/bodyweight，HW/BW)。

心功能检测　各组小鼠充分麻醉后，行常规超声心动图(VisualSonicsVevo超声系统)检测。用刀片在各组小鼠胸前区备皮，麻醉后选择小鼠心率维持＞次/min，以减少心率对射血分数(EF)的影响。采用M型超声心动图像，每只小鼠至少检测2次并连续采集5个心动周期的参数，取均值用于统计比较。

Westernblot检测蛋白表达　将－80℃保存心脏取出，加入μl组织裂解液，电动匀浆器以r/min匀浆3次，每次8s。于4℃，r/min，离心20min后吸取上清。通过BCA法测定蛋白溶度[4]，校正后在上清中加了缓冲液煮沸5min。然后进行电泳，电泳结束后将蛋白转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，5%脱脂牛奶4℃孵育1h后，分别加入LC3(1∶)、p62(1∶)一抗4℃过夜，次日用TBST(NaCl8g、ＫCl0.2g、Trisbase3g、加入浓盐酸调pH至7.4，加双蒸水至1L，最后加入0.1%tween20)洗膜3次，每次10min，室温下加入相应二抗(1∶)孵育2～3h；再用TBST洗膜3次，每次10min，最后通过ECL显影、曝光。利用AlphaEaseFc分析软件测定条带灰度值，并以内参GAPDH进行对比标化。

统计学处理　

　结果

4周龄Hsp27Tg鼠出现心肌肥厚　4周龄的Hsp27Tg鼠和WT小鼠心脏大体形态见图1A，可见Hsp27Tg鼠心脏体积显著＞WT鼠，经过测定，Hsp27Tg鼠HW/BW显著高于WT鼠，增加了37.3%(P＜0.01，图1B)。

4周龄Hsp27Tg鼠出现心功能不全　超声心动图测定4周龄小鼠的结果显示：与WT组比较，心脏肥大的Hsp27Tg鼠的EF%和FS%分别下降了14.9%、18.4%(P＜0.01)。见图2。心肌肥大Hsp27Tg鼠心肌组织中自噬水平升高　4周龄WT和Hsp27Tg组心肌Westernblot检测结果显示：与WT组比较，Hsp27Tg组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著上调了.9%，p62蛋白水平降低了41.4%(P＜0.01)。见图3。WM抑制心肌肥大Hsp27Tg鼠心肌组织中自噬水平　与溶剂组比较，WM处理3周的Hsp27Tg鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著下降了90.8%，p62蛋白水平升高了68.8%(P＜0.01)。见图4。WM改善心肌肥大小鼠的心功能不全　超声心动图检测显示：与溶剂组比较，WM组的EF%和FS%分别增加了42.1%和51.8%(P＜0.01)，见图5。　讨论

Hsp27是小分子热休克蛋白家族的重要成员之一，已被证明是重要的心脏保护性分子伴侣。我们早期研究发现在Hsp27中度表达的转基因小鼠可以有效抵抗内毒素的心脏毒性，改善内毒素血症所致的心功能不全。然而在心肌肥厚患者中发现心肌组织中Hsp27表达水平与心肌肥厚的进展呈正相关，结合我们前期研究发现8周龄时Hsp27高表达的转基因Tg10小鼠产生还原应激所致的病理性心肌肥厚，共同提示高表达的Hsp27可以促进心肌肥厚发生。在本实验中，我们观察发现4周龄的Tg组小鼠已发生心肌肥厚和心功能不全。

自噬是细胞内长寿蛋白质和多种细胞器降解回收再利用的自主过程，而线粒体自噬则主要负责清除异常线粒体和线粒体相关蛋白。适当的自噬/线粒体自噬活性对于维持心肌细胞的能量代谢稳态是必不可少的。然而，自噬/线粒体自噬的过度激活会通过非选择性降解正常的线粒体和线粒体相关蛋白，进一步加重线粒体损伤和能量代谢障碍，形成能量紊乱的恶性循环，最终引起心脏结构和功能的恶化。本研究发现心肌肥大小鼠心肌组织中LC3-Ⅱ增加而p62水平下降，提示自噬的过度激活可能在病理性心肌肥厚心功能不全中发挥作用。为了验证上述假设，本研究选用已被广泛验证的自噬抑制剂WM应用于心肌肥厚。已有文献报道，WM抑制Ⅲ型PI3Ｋ活性，是一种重要的自噬抑制剂。WM通过抑制自噬底物向溶酶体内的运输发挥抑制自噬的作用，并且具有很高的选择性。通过连续3周的WM腹腔注射，我们发现WM虽然没有逆转心肌肥厚的发生，但其有效抑制心肌组织内自噬活性，改善心肌细胞和线粒体损伤并提高心肌能量代谢水平从而减轻病理性心肌肥厚的进一步发展。

综上所述，WM能够有效抑制Hsp27高表达所致病理性心肌肥厚模型中自噬活性，改善肥大性心脏的心功能不全，而阻止病理性心肌肥厚向心衰转变，这为临床延缓病理性心肌肥厚进展及心衰治疗提供新靶点和新思路。然而，通过抑制自噬活性以达到保护线粒体和改善能量代谢的具体机制有待进一步实验探讨。

《实用老年医学》年5月第31卷第5期

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