周璐1王雅枫2张岳甫1苏娃婷1夏中元1雷少青1

1医院麻醉科，武汉；2华中科技大学同医院麻醉科，武汉

国际麻醉学与复苏杂志,,43(03):-.

DOI：10./cma.j.cn-?

基金项目

国家自然科学基金（）

ORIGINALARTICLES

本研究在高糖缺氧/复氧（HR）诱导的心肌细胞损伤模型上探讨蛋白激酶Cβ2（PKCβ2）在心肌细胞焦亡中的作用机制。

1材料与方法

1.1　H9c2心肌细胞培养及高糖HR损伤模型制备

大鼠心肌细胞来源的H9c2心肌细胞系购自中国科学院细胞库。在37℃、95%空气及5%CO2的湿润环境下，采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养细胞。当细胞密度为70%~90%时，使用胰蛋白酶消化细胞传代或铺板。按随机数字表法将心肌细胞分组（每组6孔）：低糖组（LG组）、低糖缺氧/复氧组（LG+HR组）、高糖组（HG组）、高糖缺氧/复氧组（HG+HR组）、高糖缺氧/复氧+PKCβ2抑制剂CGP（1μmol/L）治疗组（HG+HR+CGP组）。高糖模型采用DMEM低糖培养基加入50%葡萄糖培养24h构建。HR模型采用三气培养箱缺氧（5%CO2、94%N2、1%O2）4h后复氧（95%空气、5%CO2）2h构建体外缺血/再灌注损伤（I/RI）模型。PKCβ2抑制剂CGP在细胞HR前1h加入。

1.2　细胞存活率与乳酸脱氢酶（LDH）释放水平测定

高糖与HR导致的细胞损伤通过测定细胞活力与LDH水平进行评估。细胞存活率采用细胞计数试剂盒（CCK8）进行检测，LDH释放水平采用LDH细胞毒性检测试剂盒进行检测，所有操作按照试剂盒说明书进行。

1.3　线粒体膜电位

线粒体膜电位采用JC?1染色试剂盒进行检测，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.4　Westernblot法检测细胞蛋白表达

按细胞实验分组处理细胞，处理完成后，吸净培养基并用提前预冷的PBS将培养皿清洗干净。加入适量提前预冷的裂解液，4℃冰上裂解30min。超声进一步破碎细胞，4℃r/min低温高速离心15min（离心半径为8.4cm），弃沉淀，取上清。采用BCAProteinAssayKit测定蛋白浓度。加入适量SDS?PAGE蛋白上样缓冲液（5X）后置于℃干式加热10min，采用Westernblot法测定蛋白表达。对应一抗为：甘油醛?3?磷酸脱氢酶（GAPDH），磷酸化PKCβ2（P?PKCβ2），Nod样受体蛋白?3（NLRP3），IL?1β，半胱氨酸蛋白酶?1（caspase?1）。GAPDH作为上样对照，所有结果以目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值计为目的蛋白水平。

2结果

2.1　高糖与HR对细胞存活率、LDH释放水平影响

与LG组比较，HG组、LG+HR组、HG+HR组LDH释放水平明显增加（P0.05），H9c2心肌细胞存活率下降（P0.05），细胞损伤增加；与LG+HR组比较，HG+HR组LDH释放水平增加（P0.05），细胞存活率明显降低（P0.05）；表明高糖建模成功。与HG组比较，HG+HR组LDH释放水平增加、细胞存活率明显降低（P0.05），表明HR建模成功。见图1。

2.2　高糖与HR对P?PKCβ2及NLRP3、IL?1β、caspase?1表达水平的影响

与LG组比较，HG组P‐PKCβ2、NLRP3、IL‐1β、caspase‐1表达上调（P0.05）。与HG组比较，HG+HR组P‐PKCβ2、NLRP3、IL‐1β、caspase‐1表达上调（P0.05）。与LG+HR组比较，HG+HR组P‐PKCβ2、NL‐RP3、IL‐1β、caspase‐1表达上调（P0.05）。见图2

2.3　PKCβ2抑制剂CGP对细胞存活率、LDH释放水平的影响

与HG组比较，HG+HR组、HG+HR+CGP组细胞存活率降低、LDH释放水平增加（P0.05）。与HG+HR组比较，HG+HR+CGP组细胞存活率升高、LDH释放水平降低（P0.05）。见图3。

2.4　PKCβ2抑制剂CGP对P?PKCβ2及NLRP3、IL?1β、caspase?1表达水平的影响

与HG+HR组比较，HG+HR+CGP组P?PKCβ2、NLRP3、IL?1β、caspase?1的表达下调（P0.05）。与HG组比较，HG+HR组、HG+HR+CGP组P?PKCβ2、NLRP3、IL?1β、caspase?1的表达上调（P0.05）。见图4。

2.5　PKCβ2抑制剂CGP对线粒体膜电位水平的影响

与HG组比较，HG+HR组绿色荧光（JC?1单体）细胞的比例明显增加，提示高糖与HR后心肌细胞线粒体膜电位明显降低。与HG+HR组比较，HG+HR+CGP组JC?1单体绿色荧光细胞的百分比明显降低，表明线粒体损伤减轻。见图5。

3讨论

本研究发现，高糖与HR措施可以明显增加PKCβ2活化水平，通过抑制PKCβ2过度活化可以显著降低高糖与HR损伤，这提示PKCβ2过度活化也可能是糖尿病心肌I/RI的重要机制。

本研究发现，高糖HR后心肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3、IL?1β、caspase?1水平显著升高。本研究证实，选择性抑制PKCβ2的活化可降低NLRP3炎症小体的激活，并随后降低了caspase?1的表达和IL?1β的产生，恢复线粒体膜电位水平，进而降低细胞焦亡水平，最终减少了高糖与HR诱导的心肌细胞损伤。这提示PKCβ2参与了细胞焦亡水平的调控，通过抑制PKCβ2过度活化从而降低心肌细胞焦亡水平，恢复线粒体功能是减轻糖尿病心肌I/RI的有效途径。

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