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心肌肥大是各种恶性心血管疾病，如缺血性心脏病，心律失常和心源性猝死等疾病的发病率和死亡率增加的独立危险因素。病理性心肌肥大是心脏对长期超负荷和多种过度刺激的适应性反应，表现为心肌细胞体积和蛋白质含量增加，以及间质细胞增殖。虽然补偿性心肌肥大可以增加心脏收缩力，但最终仍会发展成心室扩张和心力衰竭[1]。一方面，心肌肥大是各种心血管疾病的常见病理变化，但其病理机制尚不清楚。另一方面，对于心肌肥大的治疗上，尽管血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂已经在应用于临床，但越来越多的研究表明，上述治疗对众多患者没有显着疗效。因此，迫切需要找到有效的治疗心肌肥大的靶向药物。

丹红注射液（danhonginjction，DH）由丹参、红花两味中药组成，具有活血化瘀，通脉舒络的作用，其连续多年被《国家医保目录》收录，对于冠心病心绞痛、心肌缺血和缺血性脑病临床疗效显著。近年来，随着DH在心脑血管疾病的广泛应用，已有多篇关于DH的论文发表，其中篇是临床研究（CNKI数据库和NCBIPubMd）。既往研究表明，DH在临床治疗中对心绞痛（篇），缺血性心肌病（篇）和脑梗死（篇）有明确的保护作用。最近几年，DH越来越多被应用于心力衰竭的临床治疗中。目前尽管有大量关于DH的研究表明其可以改善上述心脑血管疾病的临床症状，然而，DH抗心脑血管疾病的直接靶点以及保护机制仍未被揭示。

本研究主要分为四部分：DH质量控制（见文章补充材料），评价DH抗心肌肥大药效，预测直接靶点，验证靶点以及分析下游蛋白质表达，如图1。

图1研究流程图

1.评价药效

运用无标记电阻（RTCA）方法评价DH对心肌肥大细胞收缩表型的影响，采用RT-PCR法以及高内涵免疫荧光（HCA）方法评价其对心肌肥大细胞形态，骨架相关蛋白表达，以及心肌损伤基因及蛋白表达。

2.富集靶点

对DH干预后心肌肥大细胞蛋白质表达进行分析，基于超几何累积分布测试对差异表达蛋白质直接关联受体（靶点）的进行富集分析。

3.靶点验证

采用监测细胞（受体过表达细胞系）胞内钙流量的方法（HTS）检测DH对潜在靶点的直接作用（包括对靶点的激动和拮抗作用），以揭示DH的直接作用靶点。

4.靶点下游蛋白分析

对心肌细胞进行蛋白质组学检测，分析DH对靶点下游生物学信号通路的干预作用。使用CluGO进行蛋白质组数据的功能注释，并用Cytoscapv3.4.0成像，构建“受体-相互作用-肥大相关基因（HYPs）”信号转导网络。

1.DH抗心肌肥大的药效验证

本研究首先验证了DH抗心肌肥大的药效，主要体现在以下几个方面：DH对心肌肥大细胞收缩功能具有正向调节作用，且呈浓度依赖性。DH可抑制心肌肥大的异常蛋白增殖。DH具有抑制心肌肥大细胞面积增大，缓解ACTN2及TNNT2表达异常增加的作用；具有抑制心肌肥大细胞NPPB基因及BNP蛋白表达异常增加的作用，且作用呈浓度依赖性。

图2.DH减缓了因心肌肥大引起的细胞收缩功能障碍。（A）DH不同时间点（3，6，12，24h）对心肌肥大细胞收缩功能的影响。（B）不同剂量DH对心肌肥大细胞收缩功能的影响（以3h为例）。（C）DH抑制肥大hiPS-CMs总蛋白异常增殖。

图3.DH抑制心肌肥大细胞面积异常增大，减轻ACTN2,TNNT2蛋白表达的异常上调。（A）不同剂量DH对心肌肥大细胞形态影响。（B）DH对心肌肥大细胞面积的影响。（C）DH对心肌肥大细胞ACTN2表达水平的影响。（D）DH对心肌肥大细胞TNNT2表达水平的影响。

图4.DH抑制心肌肥大NPPB基因以及BNP表达的异常上调。（A）不同剂量DH对心肌肥大细胞NPPB基因表达影响。（B）DH对心肌肥大细胞BNP蛋白水平影响的图片。（C）不同剂量DH对心肌肥大细胞BNP蛋白水平影响。

2.DH抗心肌肥大直接作用靶点的预测及验证

2.1DH抗心肌肥大直接作用靶点的预测

在验证DH药效的基础上，本研究通过蛋白质组学技术及相关数据分析，初步筛选出DH抗ET-1诱导的心肌肥大最为相关G蛋白偶联受体（GPCR）为内皮素受体A（ETAR）、内皮素受体B（ETBR）以及血管紧张素II1型受体（AT1R）。

图5.丹红注射液干预心肌肥大细胞相关GPCR受体以及关联蛋白。黄色代表受体；蓝色代表与受体直接关联的心肌肥大相关蛋白；红色代表丹红注射液干预后具有显著变化的蛋白。

2.2DH抗心肌肥大直接作用靶点的验证

在GPCR过表达细胞系上，运用监测胞内钙信号方法验证DH的对受体的激动或拮抗作用，从而明确DH抗心肌肥大的直接靶点。通过实时监测胞内钙信号进一步验证发现，DH对ETAR无激动或拮抗作用。DH对ETBR具有拮抗作用，IC50为25.67μL/mL；其对ETBR无激动作用。DH对AT1R具有拮抗作用，IC50为1.10μL/mL；其对AT1R无激动作用。研究结果表明DH抗心肌肥大的直接作用靶点为ETBR和AT1R。

图6.DH对ETB受体的拮抗作用。（A）ET-1对ETB受体的激动作用的剂量反应曲线。（B）波生坦对ETB受体的拮抗作用的剂量反应曲线。（C）DH对ETB受体的拮抗作用的剂量反应曲线。

图7.DH对AT1受体的拮抗作用。（A）AngII对AT1受体的激动作用的剂量反应曲线。（B）替米沙坦对AT1受体的拮抗作用的剂量反应曲线。（C）丹红注射液对AT1受体的拮抗作用的剂量反应曲线。

ETBR属于G蛋白偶联受体，在多种细胞上均有表达，包括内皮细胞，心肌细胞和星形胶质细胞等。ETBR在心血管疾病的病理过程中起着重要的作用，在病理状态下，如在高血压，缺血性心脏病和脑缺血中可观察到ETBR过表达。AT1R也是G蛋白偶联受体之一，表达于多种细胞类型，包括心肌细胞，神经元细胞和肝细胞等，可介导大多数肾素-血管紧张素系统反应如血管收缩，血管生成和醛固酮合成。在心力衰竭，高血压，糖尿病和外周动脉疾病等疾病中可观察到AT1R表达上调。在本研究中，DH在心肌肥大的病理过程中拮抗了ETBR以及AT1R，揭示了DH通过这两个作用靶点发挥心肌保护作用的关键机制。

3.DH抗心肌肥大的蛋白质组学分析

为了研究DH对直接作用靶点下游生物学通路的调节作用，本研究通过蛋白质组学方法分析不同干预条件下hiPS-CMs相关蛋白表达，并富集生物学信号通路以及关键作用蛋白。本研究一共分析了个蛋白，其中个蛋白与心肌肥大直接相关。心肌肥大模型组hiPS-CMs的蛋白质组表达发生显著改变；与模型组比较，阳性药物对照组抑制模型组异常上调蛋白表达，从蛋白质组整体表达分析，DH组与阳性药物对照组作用相似。

图8.心肌肥大细胞在不同干预条件下的蛋白质表达。红色圆点代表表达差异的蛋白；绿色圆点代表表达无显著性差异的蛋白；蓝色圆点代表心肌肥大相关蛋白及其关联蛋白。（A）模型组与溶酶组蛋白质表达比较。（B）阳性药物对照组与模型组蛋白质表达比较。（C）DH组与模型组蛋白质表达比较。

进一步分析结果表明，心肌肥大模型组中参与RNA过程的蛋白表达上调，参与细胞周期、Wnt信号通路等生物学通路中蛋白表达被抑制。与模型组比较，阳性化合物波生坦调节了参与DNA损伤、细胞反应、细胞周期等生物学通路中蛋白表达；DH组调节作用趋势与波生坦类似。DH对心肌肥大细胞的保护作用可能通过调节参与RNA过程、细胞周期、线粒体功能以及细胞骨架等相关生物学通路中蛋白表达发挥。

图9.DH调节肥大hiPS-CMs差异表达蛋白的生物学过程。红色节点表明该生物学过程中70％差异表达蛋白质被上调，绿色节点表明该生物学过程中70％差异表达蛋白质被下调。节点的颜色梯度表示重要性，其大小代表了该生物学过程中蛋白质的数量。（A）模型组与溶酶组比较，差异表达蛋白质的过表达GO通路。（B）波生坦组与模型组比较，差异表达蛋白质的过表达GO通路。（C）DH组与模型组比较，差异表达蛋白质的过表达GO通路。（D）显着差异表达的蛋白质定量信息的分级聚类，蛋白质的表达水平使用z-分数进行归一化。

本研究整合运用细胞生物学方法，蛋白质组学方法，生物信息学分析等，揭示了DH的直接作用靶点为ETBR和AT1R，同时为中药复方制剂靶点的筛选和验证提供了参考。本研究针对DH制剂多靶点、多途径的作用方式，补充了其在直接靶点研究方面的空缺。

图10.DH抗ET-1诱导的心肌肥大的保护机制示意图（“受体-相互作用-HYPs”信号转导网络）。DH通过拮抗ETBR和AT1R减轻心肌肥大，调节参与细胞周期，RNA加工，细胞骨架和线粒体功能蛋白质的表达。蓝色节点表示与心肌肥大相关的关键蛋白质，紫色节点表示与心肌肥大有关的蛋白质，绿色节点表示生物学过程。

在今后的研究中，我们将一步完善以下方面的工作。值得注意的是，在临床应用中，DH不仅对心血管疾病具有显著疗效，对脑血管疾病也具有治疗作用。DH直接作用靶点ETBR和AT1R为GPCRs，不仅在心肌细胞上表达，在神经元细胞、内皮细胞等细胞上均有表达。因此，神经元以及内皮相关疾病模型应纳入下一步研究中，以阐明DH发挥异病同治作用的机制。

图11.DH治疗心脑血管疾病的可能机制。DTs：“直接靶点”。

参考文献

[1]SchironL,FortM,PalmrioS,tal.ARviwofthMolcularMchanismsUndrlyingthDvlopmntandProgrssionofCardiacRmodling.OxidMdCllLongv.:.

研究成果于年10月在线发表在Oncotargt（IF=5.）。该研究工作得到国家自然科学基金重点项目、国家重点基础研究发展规划(计划)等项目的资助。中国中医科学院中药研究所中药新药设计课题组张旻昱、郭非非为该文章的第一作者。

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